LncRNA的一般研究策略

日期：2019-03-26 標簽：LncRNA的一般研究策略

圖1 LncRNA的一般研究策略

（1）LncRNA篩選

通過lncRNA芯片或RNA測序等方法對多對疾病模型和對照樣本組織進行lncRNA表達譜分析；通過生物信息學的方法篩選出具有表達差異的lncRNA，構建共表達網絡，預測lncRNA的靶基因；通過PCR或Northern Blot技術對候選lncRNA驗證，確定其表達差異。

（2）LncRNA全長克隆

可以通過5'RACE獲取lncRNA 5'全長，3'RACE獲取lncRNA 3'全長，最終拿到完整的lncRNA序列。

（3）表達分析

細胞水平表達：在細胞水平進行檢測表達差異。

組織分布：檢測不同組織、不同階段表達特性。

表達水平動力學變化：比較不同處理條件下，如藥物處理、誘導處理下，表達水平差異。

（4）功能研究

功能獲得性研究：構建lncRNA過表達載體。

功能缺失性研究：可通過siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，干預       lncRNA后檢測其對疾病相關基因表達影響和對細胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉移等的影響。

可通過RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法檢測與lncRNA結合的DNA、RNA、蛋白質。

表達調控：將lncRNA表達與其他領域相結合，解釋lncRNA調控機理。

轉錄因子：研究lncRNA與轉錄因子的調控機制。

染色質重塑：lncRNA表觀調控。

ceRNA機制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調控機制。

2 LncRNA的一般研究實驗手段

圖2 LncRNA的一般研究實驗手段

（1）與蛋白質的相互作用

識別lncRNA的蛋白質伙伴，可以為它們的功能的機制和路徑提高線索。RIP技術，如chemical-cross-linked RIP、native RIP (nRIP)、UV-crosslinked immunoprecipitation (CLIP)使用抗體來pulldown核蛋白復合物，然后從中分離相關RNA用于分析。每個變體都有它各自的優勢和缺陷。nRIP提供交聯產物，而CLIP在避免交聯產物的重新組合的同時用于識別RNA與蛋白質相互作用位點。這些技術可以結合高通量測序，如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq，來識別lncRNA相互作用的全部宿主蛋白質因子，盡管還需要技術手段的確認。

（2）與DNA的相互作用

有幾個實驗技術被用于識別lncRNA的基因組靶位點。以染色體免疫共沉淀（ChIP）和RIP技術的原理為基礎，使用染色體RNA免疫共沉淀（ChRIP）來識別與特殊染色體標簽相互作用的RNA。另一方面，chromatin oligo-affinity precipitation (ChOP)、chromatin isolation by RNA purification (ChIRP)、capture hybridization of RNA targets (CHART)使用標記的互補寡核苷酸來識別與目的RNA相互作用的DNA位點。

圖3 ChIRP基本實驗流程

（3）結構特征

lncRNA可以形成特殊的二級和三級結構來執行它們的功能。通過selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE)和in-line probing來獲得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq，連接其它依賴于RNA酶消化的技術，如fragmentation sequencing (FragSeq)和parallel analysis of RNA structure (PARS)。