miRNA的一般研究策略

日期：2019-03-26 標簽：miRNA的一般研究策略

miRNA也稱微RNA、microRNA，是真核生物中廣泛存在的一種長度為21-23nt的RNA分子，可通過與mRNA的結合，抑制mRNA的轉錄，因此在基因表達調控、細胞周期、生物體發育時序等方面起重要作用。

圖1 miRNA的一般研究策略及相關實驗手段

1 生物信息學預測靶基因

要對miRNA進行研究，首先需要采用生物信息學的方法預測miRNA的靶基因位點，即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。

2 靶基因的預測結果確認

進行靶位點預測之后，接著是要通過miRNA pulldown方法，識別靶基因位點。其中，有以下三種常用的pull-down方法：

（1）生物素化的miRNA pull-down（biotinylated miRNA pull-down）。通過生物素標記的合成miRNA轉染細胞，孵育后裂解細胞，用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。

圖1 miRNA的一般研究策略及相關實驗手段

1 生物信息學預測靶基因

要對miRNA進行研究，首先需要采用生物信息學的方法預測miRNA的靶基因位點，即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。

2 靶基因的預測結果確認

進行靶位點預測之后，接著是要通過miRNA pulldown方法，識別靶基因位點。其中，有以下三種常用的pull-down方法：

（1）生物素化的miRNA pull-down（biotinylated miRNA pull-down）。通過生物素標記的合成miRNA轉染細胞，孵育后裂解細胞，用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。

圖2 生物素化的miRNA pull-down

（2）標記的miRNA pull-down（labeled microRNA pull-down assay，LAMP），通過用地高辛（DIG）標記的pre-miRNA寡核苷酸與細胞提取物混合孵育，用抗地高辛的抗體做免疫共沉淀（IP），獲得被共沉淀的mRNA。

（3）核蛋白免疫共沉淀-RNA高通量測序（Ribonucleoprotein immunoprecipitation followed by microarray chip analysis，RIP-Chip，RIP-seq），通過用合成的miRNA轉染細胞，孵育后裂解細胞，用特異的抗AGO2抗體對RISC進行免疫共沉淀，對獲得的mRNA進行microarray分析。

圖3 RIP-Chip基本實驗流程

3 miRNA的直接功能確認

通過實驗方法驗證miRNA是否能特異結合靶mRNA并特異抑制其表達。

（1）3’-UTR reporter assay

通過在報告基因如熒光素酶CDS的下游3’-UTR區域插入待確認的目的基因，克隆到載體如psiCHECK-2上，載體轉染細胞，再用miRNA進行處理，如果目的基因上含有靶位點，則熒光素酶的轉錄受到抑制不發熒光。

圖4  3’-UTR報告基因基本實驗流程

圖5  3’-UTR報告基因驗證miRNA直接作用情況

（2）miRNA的上調與下調

通過人工合成miRNA模擬物（miRNA mimics）或miRNA抑制物（miRNA inhibitor），增強或抑制miRNA的抑制效果，并與對照相比。

圖6 miRNA的上調與下調驗證miRNA直接作用情況

（3）位點定向突變（site-directed mutagenesis）

首先，將待測基因反轉錄為cDNA，通過用致突變的引物對cDNA模板進行重疊PCR擴增；然后，用相關的酶（一般為Kinase-Ligase-DpnI）對cDNA模板進行消化，克隆到報告基因載體；最后，將構建好的克隆轉染至細胞，檢測報告基因的表達。若表達顯著下降，可表明靶位點定位準確。

圖7 位點定向突變基本實驗流程

4 miRNA的整體功能驗證

對miRNA的上調/下調，通過Western Blot或其他生物學通路分析實驗，探究miRNA最終是如何影響細胞、疾病等等情況。

5 miRNA的定量和定位

通過RT-qPCR、原位雜交（in situ hybridization）、microarray等實驗手段，確定miRNA的具體表達量及其所在位置，以明確補充其機理研究。